之前碰到過一些客戶，說做PCR實驗總是出現(xiàn)假陽性，明明沒有加模板最后卻擴出了產(chǎn)物。如果這種現(xiàn)象頻頻出現(xiàn)，就要注意一下操作環(huán)境了。如果你去百度上搜索“PCR出現(xiàn)假陽性了怎么辦”，下面給出的建議一定會有防止交叉污染這條建議。有人說模板DNA是大分子，溶于去離子水中，怎么會無緣無故跑出來污染環(huán)境呢？

這里涉及一個氣溶膠的概念，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，能在空氣中滯留至少幾個小時。PCR反應過程中不斷進行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，PCR管中空氣的部分形成了氣溶膠，攜帶了大量DNA擴增產(chǎn)物（注意1ng擴增產(chǎn)物中可作為模板的DNA片段的數(shù)量超過1ng起始模板中可擴增DNA片段數(shù)量的幾百萬倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個bp，要擴增的單拷貝基因片段是300 bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬分之一）。如果在實驗室打開含PCR擴增產(chǎn)物的管蓋，大量攜帶DNA擴增產(chǎn)物的氣溶膠就會涌出，擴散到空氣中，從而對環(huán)境造成污染。雖然在整個空間環(huán)境中DNA的含量很低，但是由于理論上只要有1個可做為模板的DNA 片段也能PCR擴增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。

所以在專業(yè)的PCR實驗（比如臨床PCR檢驗實驗室）室通常有四區(qū)隔離（或至少是三區(qū)隔離）的要求。

常見的三區(qū)指的是：

1、試劑配制區(qū)：PCR反應體系的配制區(qū)域。

2、標本處理區(qū)：包括擴增模板的制備，也就是我們常常提取DNA的地方；

3、PCR擴增和產(chǎn)物分析區(qū)：進行PCR擴增的區(qū)域，也是擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析的區(qū)域。

此外，如果將PCR擴增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)再次分開，就是四區(qū)隔離了。

四區(qū)隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個PCR區(qū)域之間的流動—最好的方法是干脆每個區(qū)域隔一幢樓，那肯定是最佳的隔離措施了，但操作起來肯定不現(xiàn)實，于是便有了針對不同區(qū)域設置正負壓的方法：

試劑配制區(qū)（Ⅰ區(qū)）：最潔凈的區(qū)域，保持微正壓使得外界空氣無法進入隔離污染源。并且陰性模板應該在此區(qū)加入PCR管并蓋蓋，嚴禁在此區(qū)域打開、存放裝有DNA模板的離心管；

DNA模板添加區(qū)（Ⅱ區(qū)）：保持微負壓，保證內(nèi)部空氣不外泄，以免陽性模板的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

擴增及PCR產(chǎn)物分析區(qū)（Ⅲ區(qū)）：保持微負壓，使得內(nèi)部空氣不外泄，以免擴增產(chǎn)物的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

操作時遵循Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)單一方向進行，不可逆向進行。

對于科研用途的PCR實驗室，如果無法達到嚴格的三區(qū)隔離的要求，至少也要做到兩區(qū)隔離：即正壓區(qū)和負壓區(qū)。正壓區(qū)實施Ⅰ區(qū)的功能，負壓區(qū)實施Ⅱ區(qū)，Ⅲ區(qū)的功能。

最忌諱也是最可怕的是反過來，在正壓區(qū)實施Ⅲ區(qū)的功能。PCR實驗室不同區(qū)域間的空氣是互相之間否有流通是關(guān)鍵所在。

如果有問，我們的實驗室沒有正負壓的區(qū)分，或者是全負壓，全正壓怎么辦呢？那我們的建議是：別怕麻煩，找個遠離Ⅲ區(qū)（通俗地講就是打開PCR擴增產(chǎn)物的蓋子區(qū)域，比如電泳區(qū)）的實驗室當做PCR I區(qū)使用，能省掉后續(xù)更多的麻煩。

既然PCR三區(qū)隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請注意以下細節(jié)，思考一下氣溶膠來自哪里：

1. 每個區(qū)域都應配備專用的移液器，不可交叉混用。

2. 每個區(qū)域都應配備專用的移液器吸頭，不可交叉混用。

3. 如果條件允許，在PCRⅢ區(qū)工作結(jié)束后再次進入PCR I區(qū)需要更換實驗服、一次性鞋套、帽子、手套。

4. 在PCR I區(qū)、PCRⅡ區(qū)配備帶濾芯吸頭。